Rt-QPCR EasyTM Taqman ένα βήμα πραγματικό - κύριο μίγμα χρονικού rt-pcr

RT -RT-qPCR EasyTM (ένα βήμα) - Taqman

Για πραγματικό - χρονικό PCR που χρησιμοποιεί cDNA, καθαρισμένο DNA

Εισαγωγή προϊόντων

Τα One-Step εύκολα προϊόντα σειράς rt-pcr Foregene πραγματοποιούν την ενσωματωμένη αντίδραση από το RNA στο double-stranded DNA, δηλ., αντίστροφη μεταγραφή και PCR η ενίσχυση ολοκληρώνεται στον ίδιο σωλήνα φυγοκεντρωτών αντίδρασης και το ίδιο σύστημα αντίδρασης, κατά συνέπεια τα πειραματικά βήματα απλουστευμένα, το πειραματικό σχέδιο που βελτιστοποιούνται, και η πειραματική αποδοτικότητα βελτιωμένη.

Το RT -RT-qPCR EasyTM (ένα βήμα) - Taqman που χρησιμοποιεί την πολυμεράση DNA Foregene HotStar Taq, το βελτιστοποιημένο σύστημα Taqman qPCR μπορεί γρήγορα και συγκεκριμένα να εκτελέσει πραγματικό - χρονική RT -RT-qPCR ποσοτική ανίχνευση των προτύπων RNA ιχνών.

Όροι μεταφορών και αποθήκευσης

• Όροι μεταφορών: Ολόκληρη η διαδικασία μεταφέρεται σε ένα χαμηλής θερμοκρασίας παγοκιβώτιο για να εξασφαλίσει ότι η εξάρτηση είναι σε ένα κράτος <4>
• Όροι αποθήκευσης: Η εξάρτηση αποθηκεύεται σε -20℃. Αποθηκεύστε το προϊόν σε ένα σταθερό ψυγείο θερμοκρασίας σε -20℃ αμέσως μετά από την παραλαβή. Εάν οι όροι αποθήκευσης είναι κατάλληλοι, το προϊόν δεν θα υποβιβάσει οποιαδήποτε απόδοση κατά τη διάρκεια της ενός έτους περιόδου ισχύος.

Πληροφορίες τμημάτων εξαρτήσεων

• 2× RT -RT-qPCR EasyTM μίγμα-Taqman: Το Foregene αντίστροφο Transcriptase, RNase ανασταλτικός παράγοντας, πολυμεράση DNA Foregene HotStar Taq, βελτιστοποίησε την αναλογία των dNTPs, Mg2+, σταθεροποιητής, ανυψωτής, και optimizer.
• Χρωστική ουσία αναφοράς ROX: Γενικά χρησιμοποιημένος σε πραγματικό - χρονικό PCR θερμικά cyclers των επιχειρήσεων όπως η ABI, Stratagene, κ.λπ., για να ρυθμίσει τη διαφορά μεταξύ PCR των σωλήνων που προκαλείται από PCR τα λάθη φόρτωσης δειγμάτων. Η συγκέντρωση της χρωστικής ουσίας αναφοράς ROX που απαιτείται από τα διαφορετικά όργανα είναι διαφορετική, και ο χρήστης μπορεί να την προσθέσει σύμφωνα με τη συνιστώμενη συγκέντρωση του οργάνου.

Προφυλάξεις:

τα αντιδραστήρια του u πρέπει να αποφύγουν το επαναλαμβανόμενο πάγωμα και το ξεπαγώνω, διαφορετικά η απόδοση των αντιδραστηρίων θα μειωθεί ή θα γίνει άκυρη.

u που τα αντιδραστήρια στην εξάρτηση πρέπει να προστατευθούν από ελαφρύ και να αποθηκευτούν σε -20°C.

u που συστήνεται να χρησιμοποιηθεί η φρέσκια εξαγωγή δειγμάτων ή το RNA προτύπων που αποθηκεύεται σε -80°C (το RNA πρέπει να αποφύγει το επαναλαμβανόμενο πάγωμα και το ξεπαγώνω).

το u προκειμένου να αποφευχθεί RNase η μόλυνση, παρακαλώ εκτελεί το πείραμα στο RNase-ελεύθερο διάστημα οι άκρες σιφωνίων και PCR οι σωλήνες χρησιμοποιούμενοι πρέπει να είναι RNase-ελεύθεροι και γάντια και μάσκες ένδυσης μίας χρήσης.

u που αυτή η εξάρτηση πρέπει να χρησιμοποιηθεί με τους συγκεκριμένους εγχυτήρες για τα πειράματα. Παρακαλώ επιλέξτε τους συγκεκριμένους εγχυτήρες για το γονίδιο που ενισχύεται σύμφωνα με τις ανάγκες του πειράματος.

το u πριν τη χρήση, έβαλε 2× RT -RT-qPCR EasyTM μίγμα-Taqman στον πάγο για να λειώσει εντελώς, να τινάσει και να αναμίξει καλά πριν τη χρήση η προετοιμασία του συστήματος πρέπει να χρησιμοποιηθεί σε ένα λουτρό πάγου για να βελτιώσει την απόδοση της εξάρτησης και να αυξήσει PCR την ενίσχυση.

Συγκέντρωση RNA προτύπων

RT -RT-qPCR EasyTM (ένα βήμα) - Taqman: (1 συνολικό σύστημα)/20 RNA PG-100 NG μl.

Οδηγός λειτουργίας

Α: Προετοιμασία των υλικών και των αντιδραστηρίων

• Προετοιμάστε το έτοιμο πρότυπο RNA (συστήνεται να χρησιμοποιηθούν οι συνολικές εξαρτήσεις σειράς εξαρτήσεων απομόνωσης RNA Foregene για να εξαγάγει και να καθαρίσει το RNA), τους συγκεκριμένους εγχυτήρες (10 μM) και τα σχετικά αναλώσιμα και τα όργανα.

Σημείωση: Παρακαλώ εξασφαλίστε την ακεραιότητα του RNA και προσπαθήστε να χρησιμοποιήσετε το RNA που εξάγεται από τα φρέσκα δείγματα.

• Τεθειμένο 2× RT -RT-qPCR EasyTM μίγμα-Taqman, RNase-ελεύθερη χρωστική ουσία αναφοράς ddH2O, και 20× ROX (εάν είναι απαραίτητο) στον πάγο για να το αφήσει να λειώσει φυσικά, και να τινάσει τον τοίχο σωλήνων που αναμιγνύει μέχρι τη χρήση.

Β: Προετοιμασία συστημάτων RT -RT-qPCR

2× RT -RT-qPCR EasyTM μίγμα-Taqman είναι κατάλληλο και γρήγορο να χρησιμοποιήσει, και αποφεύγει τη ρύπανση κατά τη λειτουργία και τα πειραματικά λάθη που προκαλούνται από τις πολλαπλάσιες προετοιμασίες του συστήματος αντίδρασης στο μέγιστο βαθμό. Κατά χρησιμοποίηση, μόνο τη μισός ο όγκος του συστήματος αντίδρασης (παραδείγματος χάριν, εάν το σύστημα αντίδρασης είναι 20 μl, πάρτε 10 τη λύση μl 2× RT -RT-qPCR EasyTM μίγμα-Taqman), προσθέτει το κατάλληλο ποσό προτύπου RNA και συγκεκριμένων εγχυτήρων, και προσθέτει RNase-ελεύθερο ddH2O για να αποτελέσει τον όγκο. Η συγκεκριμένη προετοιμασία συστημάτων αντίδρασης RT -RT-qPCR μπορεί να αναφερθεί στον πίνακα 1 κατωτέρω.

Πίνακας 1: Προετοιμασία συστημάτων RT -RT-qPCR

Σημείωση: Ο μπροστινός εγχυτήρας και ο αντίστροφος εγχυτήρας είναι συγκεκριμένοι εγχυτήρες για το γονίδιο στόχων. Το σύστημα qPCR μπορεί να ρυθμιστεί σύμφωνα με τις πειραματικές ανάγκες και PCR το πρότυπο. Για την τελική συγκέντρωση των περισσότερων εγχυτήρων, συστήνουμε 400nM. Παρακαλώ ρυθμίστε τη δόση του συγκεκριμένων εγχυτήρα και του ελέγχου σύμφωνα με την έτοιμη συγκέντρωση σύμφωνα με τη συνιστώμενη τελική συγκέντρωσή μας. Για το qPCR με το σύστημα 50μl, παρακαλώ αναφερθείτε στο σύστημα 20μl για να ρυθμίσετε το ποσό αντιδραστηρίων αναλογικά.

1*: Επιλέξτε την κατάλληλη τελική συγκέντρωση της χρωστικής ουσίας αναφοράς ROX σύμφωνα με τα διαφορετικά ποσοτικά PCR όργανα. Η βέλτιστη συγκέντρωση της χρωστικής ουσίας αναφοράς ROX για τις κοινές ποσοτικές PCR μηχανές παρουσιάζεται στον ακόλουθο πίνακα:

Γ: Ρύθμιση συστημάτων αντίδρασης RT -RT-qPCR

• Μετά από να προετοιμάσει το σύστημα RT -RT-qPCR σε σχέση με τον ανωτέρω πίνακα, μίγμα ήπια (μπορείτε να χρησιμοποιήσετε μια άκρη σιφωνίων που εισάγει στο σιφώνιο ήπια μπορείτε επίσης να αναμίξετε σε ένα vortexer και να υποβάλετε σε φυγοκέντρωση εν συντομία για να συλλέξετε το υγρό που διασκορπίζεται στον τοίχο ή το σωλήνα ΚΑΠ σωλήνων, και να τοποθετήσετε στο παγοκιβώτιο για μελλοντική χρήση).
• Αναφερθείτε στις τοποθετήσεις προγράμματος αντίδρασης RT -RT-qPCR (πίνακας 2) για να θέσετε τη θερμοκρασία και το χρόνο της αντίδρασης.

Σημείωση: Προκειμένου να εξασφαλιστεί η δραστηριότητα 2× RT -RT-qPCR EasyTM μίγμα-Taqman και να βελτιωθεί η αποδοτικότητα ενίσχυσής του, είναι καλύτερο να προετοιμαστεί το σύστημα αντίδρασης RT -RT-qPCR μετά από την καθιέρωση το PCR πρόγραμμα οργάνων, έτσι ώστε το πρόγραμμα αντίδρασης μπορεί να εισαχθεί αμέσως αφότου ολοκληρώνεται η προετοιμασία συστημάτων.

• Προκειμένου να αποκτηθεί η καλύτερη επίδραση qPCR, PCR κλίσης μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να βελτιστοποιήσει τους όρους αντίδρασης για τα διαφορετικά πρότυπα και τους διαφορετικούς εγχυτήρες.

Σημείωση: Η σειρά θερμοκρασίας επέκτασης της πολυμεράσης DNA Foregene Hotstar Taq που παρέχεται σε αυτήν την εξάρτηση είναι: 60-72℃, και η καλύτερη θερμοκρασία επέκτασης είναι 72℃.

Ο ακόλουθος είναι ένα παράδειγμα των όρων αντίδρασης RT -RT-qPCR. Συστήνεται να χρησιμοποιηθεί μια σε δύο στάδια μέθοδος για PCR την αντίδραση. Όταν η συγκέντρωση προτύπων είναι πάρα πολύ χαμηλή για να προκαλέσει τη μη συγκεκριμένη ενίσχυση, η χαμηλή αξία του TM εγχυτήρων οδηγεί στη χαμηλή αποδοτικότητα ενίσχυσης ή η φτωχή επανάληψη καμπυλών ενίσχυσης, κ.λπ., αυτό συστήνεται για να δοκιμάσει τη σε τρία στάδια μέθοδο για PCR την αντίδραση. Αναφερθείτε στον πίνακα 2-1 (σε δύο στάδια μέθοδος) και παρουσιάστε 2-2 (σε τρία στάδια μέθοδος) για τον καθορισμό των όρων αντίδρασης RT -RT-qPCR.

Πίνακας 2-1: Ρύθμιση προγράμματος αντίδρασης RT -RT-qPCR (σε δύο στάδια μέθοδος)

Πίνακας 2-2: Ρύθμιση προγράμματος αντίδρασης RT -RT-qPCR (σε τρία στάδια μέθοδος)

1*: Ο αντίστροφος χρόνος μεταγραφής μπορεί να ρυθμιστεί σύμφωνα με τις πειραματικές ανάγκες. Τα γενικά ενδογενή γονίδια όπως το β-ακτίνιο χρειάζονται μόνο 10 λεπτά για να ανιχνεύσει τα συγκεκριμένα εκφρασμένα γονίδια, ο αντίστροφος χρόνος μεταγραφής μπορεί να παραταθεί κατάλληλα όπως απαιτείται.

2*: Θέστε έναν συγκεκριμένο χρόνο σύμφωνα με το μήκος του ενισχυμένου τεμαχίου στόχων. Η ταχύτητα ενίσχυσης της πολυμεράσης DNA Foregene HotStar Taq είναι 2kb/min

Σημείωση: PCR οι όροι αντίδρασης ποικίλλουν ανάλογα με τους δομικούς όρους του προτύπου, των εγχυτήρων, κ.λπ. Για τα πρότυπα RNA με τις σύνθετες δευτεροβάθμιες δομές, συστήνεται να χρησιμοποιηθεί 42℃ για το πρώτο βήμα της αντίστροφης μεταγραφής. Στη συγκεκριμένη λειτουργία, είναι απαραίτητο να σχεδιαστούν οι βέλτιστοι όροι αντίδρασης σύμφωνα με τους συγκεκριμένους όρους όπως το μέγεθος του τεμαχίου στόχων, η ακολουθία βάσεων του ενισχυμένου τεμαχίου και του περιεχομένου ΑΕΡΙΑΣ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΊΑΣ και του μήκους του εγχυτήρα, συμπεριλαμβανομένης της ανοπτώντας θερμοκρασίας, του χρόνου επέκτασης, κ.λπ.

Ροή εργασίας: