Προετοιμασία και προφυλάξεις εξαγωγής RNA

Αποστείρωση των ακρών σιφωνίων και των σωλήνων EP, κ.λπ.

1. Προετοιμάστε 0,1% (ένας χιλιοστός) DEPC (ιδιαίτερα τοξική ουσία) με το εξιοντισμένο νερό, το χρησιμοποιήστε προσεκτικά σε μια κουκούλα καπνών, και το αποθηκεύστε σε 4°C μακρυά από το φως

Το νερό DEPC είναι καθαρό νερό που αντιμετωπίζεται με DEPC και αποστειρώνω από υψηλής θερμοκρασίας και την υψηλή πίεση. Δοκιμασμένος για να είναι χωρίς RNase, DNase και πρωτεϊνάση.

2. Βάλτε την άκρη σιφωνίων και το σωλήνα EP σε 0,1% DEPC, και εξασφαλίστε ότι την άκρη σιφωνίων και ο σωλήνας EP γεμίζουν με 0,1% τμήμα.

3. Προστατεύστε από το φως, αφήστε τη στάση, ολονυκτίς (12-24h)

4. Το κιβώτιο που περιέχει την άκρη και το σωλήνα EP δεν πρέπει να ενυδατωθεί σε DEPC. Μετά από κατά προσέγγιση να αφαιρέσει το νερό DEPC στην άκρη ή το σωλήνα EP, το συσκευάστε επάνω και το τυλίξτε επάνω.

5. 121 βαθμοί Κελσίου, 30min

6. 180 βαθμοί Κελσίου, ξεραίνουν για αρκετές ώρες (τουλάχιστον 3 ώρες)

Σημείωση: α. φορέστε τα γάντια και τις μάσκες λατέξ κατά τη χειρισμό DEPC! β, ή χωρίς αποστείρωση DEPC, 130 ℃, χύτρα πιέσεως 90min (πολλοί εργαστηριακή υψηλής θερμοκρασίας αποστείρωση δύο φορές)

Εκτιμήσεις εξαγωγής RNA

Δύο σημαντικά φαινόμενα της αποτυχίας απομόνωσης RNA ιστού

Η υποβάθμιση RNA και τα υπολείμματα ακαθαρσιών στους ιστούς, σχετικά με την υποβάθμιση, εξετάστε αρχικά γιατί το RNA που εξάγεται από τα καλλιεργημένα κύτταρα δεν υποβιβάζεται εύκολα. Τα υπάρχοντα αντιδραστήρια όλα εξαγωγής RNA περιέχουν τα συστατικά που εμποδίζουν γρήγορα RNase. Προσθέστε το lysate στα καλλιεργημένα κύτταρα, και το αναμίξτε απλά, όλα τα κύτταρα μπορούν να αναμιχθούν λεπτομερώς με το lysate, και τα κύτταρα lysed εντελώς. Αφότου lysed τα κύτταρα, τα ενεργά συστατικά στο lysate εμποδίζουν αμέσως ενδοκυτταρικό RNase, έτσι το RNA παραμένει άθικτο. Δηλαδή, επειδή τα καλλιεργημένα κύτταρα εύκολα και πλήρως έρχονται σε επαφή με με το lysate, το RNA τους δεν υποβιβάζεται εύκολα αφ' ετέρου, το RNA στον ιστό υποβιβάζεται εύκολα επειδή τα κύτταρα στον ιστό δεν είναι εύκολο γρήγορα να έρθουν σε επαφή με το lysate. λόγω της ικανοποιητικής επαφής. Έτσι, να υποθέσει υπάρχει ένας τρόπος να μετατραπεί ο ιστός σε μονό κύτταρο ενώ η εμποδίζοντας δραστηριότητα RNA, το πρόβλημα της υποβάθμισης μπόρεσε να λυθεί εντελώς.

Η άλεση υγρού αζώτου είναι η αποτελεσματικότερη τέτοια μέθοδος. Εντούτοις, η μέθοδος άλεσης υγρού αζώτου είναι πολύ ενοχλητική, ειδικά όταν ο αριθμός δειγμάτων είναι μεγάλος. Αυτό έδωσε αφορμή για το επόμενο καλύτερο πράγμα: homogenizer. Η homogenizer μέθοδος δεν εξετάζει το θέμα για το πώς RNase η δραστηριότητα είναι εμποδισμένη προτού να έρθουν σε επαφή με τα κύτταρα με το lysate, αλλά μάλλον προσεύχεται ότι το ποσοστό διάσπασης ιστού είναι γρηγορότερο από το ποσοστό στο οποίο ενδοκυτταρικό RNase υποβιβάζει το RN.

Η επίδραση ηλεκτρικό homogenizer είναι καλύτερη, και η επίδραση homogenizer γυαλιού είναι φτωχή, αλλά γενικά, η homogenizer μέθοδος δεν μπορεί να αποτρέψει το φαινόμενο υποβάθμισης. Επομένως, εάν η εξαγωγή υποβιβάζεται, αρχικό ηλεκτρικό homogenizer πρέπει να χρησιμοποιηθεί για τη λείανση με το υγρό άζωτο αρχικό homogenizer γυαλιού πρέπει να αλλάξουν ηλεκτρικό homogenizer ή να αλεστεί άμεσα με το υγρό άζωτο. Το πρόβλημα είναι σχεδόν 100% εφικτό. πάρτε επιλυμένος.

Το πρόβλημα υπολειμμάτων ακαθαρσιών που έχει επιπτώσεις στα επόμενα πειράματα έχει τις πιό διαφορετικές αιτίες από την υποβάθμιση, και οι λύσεις είναι αντίστοιχα διαφορετικές. Συμπερασματικά, εάν υπάρχει υποβάθμιση ή υπόλοιπες ακαθαρσίες στον ιστό, η μέθοδος/το αντιδραστήριο εξαγωγής για το συγκεκριμένο πειραματικό υλικό πρέπει να βελτιστοποιηθεί. Δεν ειναι απαραίτητο να χρησιμοποιήσετε τα πολύτιμα δείγματά σας για τη βελτιστοποίηση: μπορείτε να αγοράσετε μερικά μικρά ζώα όπως τα ψάρια/το κοτόπουλο από την αγορά, να πάρουν το αντίστοιχο μέρος του υλικού για την εξαγωγή RNA, και το άλλο μέρος για την πρωτεϊνική εξαγωγή - αλέστε με το στόμα, το στομάχι και το απόσπασμα εντέρων.

Το RNA στόχων του αποσπασματικού RNA χρησιμοποιείται για τα διαφορετικά πειράματα συνέχειας, και οι ποιοτικές απαιτήσεις της είναι διαφορετικές

cDNA η κατασκευή βιβλιοθηκών απαιτεί την ακεραιότητα RNA χωρίς υπολείμματα ανασταλτικών παραγόντων ενζυμικής αντίδρασης Βόρειος απαιτεί την υψηλότερη ακεραιότητα RNA και τις χαμηλότερες απαιτήσεις για τα υπολείμματα ανασταλτικών παραγόντων ενζυμικής αντίδρασης Το rt-pcr δεν απαιτεί την πάρα πολύ υψηλή ακεραιότητα RNA, αλλά εμποδίζει τις ενζυμικές αντιδράσεις. Οι απαιτήσεις υπολειμμάτων είναι αυστηρές. Η εισαγωγή καθορίζει την παραγωγή κάθε φορά που ο στόχος είναι να ληφθεί το RNA υψηλότερης αγνότητας, θα κοστίσει οι άνθρωποι και τα χρήματα.

Συλλογή/αποθήκευση των δειγμάτων

Οι παράγοντες που έχουν επιπτώσεις στην υποβάθμιση αφότου αφήνει το δείγμα στη διαβίωση body/or το αρχικό περιβάλλον αύξησης, τα ενδογενή ένζυμα στο δείγμα θα αρχίσουν να υποβιβάζουν το RNA, και το ποσοστό υποβάθμισης συσχετίζεται με το περιεχόμενο των ενδογενών ενζύμων και τη θερμοκρασία. Παραδοσιακά, υπάρχουν μόνο δύο τρόποι να εμποδιστεί εντελώς η ενδογενής ενζυμική δραστηριότητα: προσθέστε lysate αμέσως και ομογενοποιήστε λεπτομερώς και γρήγορα περικοπή στα μικρά κομμάτια και αμέσως πάγωμα στο υγρό άζωτο. Και οι δύο προσεγγίσεις απαιτούν τη γρήγορη λειτουργία. Το τελευταίο είναι κατάλληλο για όλα τα δείγματα, ενώ το πρώτο είναι μόνο κατάλληλο για τους ιστούς με το χαμηλό περιεχόμενο των κυττάρων και των ενδογενών ενζύμων και ευκολότερο να ομογενοποιήσουν. Συγκεκριμένα, ιστός εγκαταστάσεων, συκώτι, θύμος αδένας, πάγκρεας, σπλήνα, εγκέφαλος, λίπος, ιστός μυών, κ.λπ. είναι καλύτερα παγωμένος με το υγρό άζωτο πρίν προχωρά.

Τεμαχισμός και ομογενοποίηση των δειγμάτων

Οι παράγοντες που έχουν επιπτώσεις στην υποβάθμιση και τον τεμαχισμό δειγμάτων παραγωγής είναι για τη λεπτομερή ομογενοποίηση, η οποία είναι για την πλήρη και πλήρη απελευθέρωση του RNA. Τα κύτταρα μπορούν να ομογενοποιηθούν άμεσα χωρίς σπάσιμο. Οι ιστοί μπορούν να ομογενοποιηθούν μόνο μετά από το σπάσιμο. Η ζύμη και τα βακτηρίδια πρέπει να σπαστούν με τα αντίστοιχα ένζυμα προτού να μπορέσουν να ομογενοποιηθούν. Οι ιστοί με τη χαμηλότερη ενδογενή ενζυμική ικανοποιημένη και ευκολότερη ομογενοποίηση μπορούν να συντριφθούν και να ομογενοποιηθούν κάποτε στο lysate από homogenizer ιστός εγκαταστάσεων, συκώτι, θύμος αδένας, πάγκρεας, σπλήνα, εγκέφαλος, λίπος, ιστός μυών και άλλα δείγματα, είναι είτε υψηλοί στα ενδογενή ένζυμα είτε δεν είναι εύκολα ομογενοποιημένοι, έτσι η διάσπαση και η ομογενοποίηση ιστού πρέπει να εκτελεσθούν χωριστά. Η πιό αξιόπιστη και παραγωγικότερη μέθοδος τεμαχισμού αλέθει με το υγρό άζωτο, και η πιό αξιόπιστη μέθοδος ομογενοποίησης είναι η χρήση ηλεκτρικό homogenizer. Μια ειδική σημείωση για την άλεση με το υγρό άζωτο: το δείγμα δεν πρέπει να ξεπαγωθεί κατά τη διάρκεια της ολόκληρης διαδικασίας άλεσης, δεδομένου ότι τα ενδογενή ένζυμα είναι πιθανότερο να λειτουργήσουν όταν παγώνουν.

Επιλογή του lysate

Έχοντας επιπτώσεις στην ευκολία της λειτουργίας και τους παράγοντες των υπόλοιπων ενδογενών ακαθαρσιών οι συνήθως χρησιμοποιημένες λύσεις λύσης μπορούν σχεδόν να εμποδίσουν τη δραστηριότητα RNase. Επομένως, το σημείο κλειδί της επιλογής μιας λύσης λύσης είναι να εξετάσει σε σχέση με με τη μέθοδο καθαρισμού. Υπάρχει μια εξαίρεση: τα δείγματα με την υψηλή ενδογενή ενζυμικό περιεκτικότητα σε συστήνονται για να χρησιμοποιήσουν ένα lysate που περιέχει τη φαινόλη για να αυξήσουν τη δυνατότητα να αδρανοποιηθούν τα ενδογενή ένζυμα.

Επιλογή της μεθόδου καθαρισμού

Οι παράγοντες που έχουν επιπτώσεις στις υπόλοιπες ενδογενείς ακαθαρσίες, ταχύτητα εξαγωγής για τα καθαρά δείγματα όπως τα κύτταρα, ικανοποιητικά αποτελέσματα μπορούν να ληφθούν με σχεδόν οποιαδήποτε μέθοδο καθαρισμού προσιτή. Αλλά για πολλά άλλα δείγματα, ειδικά εκείνους με τα υψηλά επίπεδα των ακαθαρσιών όπως οι εγκαταστάσεις, το συκώτι, τα βακτηρίδια, κ.λπ., που επιλέγουν τον κατάλληλο καθαρισμό μια μέθοδος είναι κρίσιμη. Η φυγοκεντρική μέθοδος καθαρισμού στηλών έχει μια γρήγορη ταχύτητα εξαγωγής και μπορεί αποτελεσματικά να αφαιρέσει τις ακαθαρσίες που έχουν επιπτώσεις στην επόμενη ενζυματική αντίδραση του RNA, αλλά είναι ακριβό (Foregene μπορεί να προσφέρει τις οικονομικώς αποδοτικές εξαρτήσεις, περισσότερο κρότο λεπτομερειών εδώ) η χρησιμοποίηση των οικονομικών και κλασικών μεθόδων καθαρισμού, όπως LiCl η πτώση, μπορεί επίσης να επιτύχει τα ικανοποιητικά αποτελέσματα, αλλά ο χρόνος λειτουργίας είναι μακροχρόνιος.

«Τρεις πειθαρχίες και οκτώ προσοχές» για την εξαγωγή RNA

Πειθαρχία 1: Βάλτε ένα τέλος στη μόλυνση των εξωγενών ενζύμων.

Σημείωση 1: Αυστηρά μάσκες και γάντια ένδυσης.

Σημείωση 2: Οι σωλήνες φυγοκεντρωτών, τα κεφάλια ακρών, οι ράβδοι σιφωνίων, οι δεξαμενές ηλεκτροφόρησης, και οι πειραματικοί πάγκοι που περιλαμβάνονται στο πείραμα πρέπει να ξεφορτωθούν λεπτομερώς.

Σημείωση 3: Τα αντιδραστήρια/οι λύσεις που περιλαμβάνονται στο πείραμα, ειδικά νερό, πρέπει να είναι RNase-ελεύθερα.

Πειθαρχία 2: Εμποδίστε τη δραστηριότητα των ενδογενών ενζύμων

Σημείωση 4: Επιλέξτε μια κατάλληλη μέθοδο ομογενοποίησης.

Σημείωση 5: Επιλέξτε ένα κατάλληλο lysate.

Σημείωση 6: Ελέγξτε το αρχικό ποσό του δείγματος.

Πειθαρχία 3: Διευκρινίστε το σκοπό εξαγωγής σας

Σημείωση 7: Με οποιοδήποτε σύστημα lysate που πλησιάζει το μέγιστο αρχικό ποσό δείγματος, το ποσοστό επιτυχίας εξαγωγής μειώνεται αισθητά.

Σημείωση 8: Το μόνο οικονομικό κριτήριο για την επιτυχή εξαγωγή RNA είναι μια επιτυχία στα επόμενα πειράματα, όχι παραγωγή.

Top 10 πηγές RNase μόλυνσης

1. Τα δάχτυλα είναι η πρώτη πηγή εξωγενών ενζύμων, έτσι τα γάντια πρέπει να φορεθούν και να αντικατασταθούν συχνά. Επιπλέον, οι μάσκες πρέπει επίσης να φορεθούν, επειδή η αναπνοή είναι επίσης μια σημαντική πηγή ενζύμων. Ένα πρόσθετο όφελος μια μάσκα γαντιών είναι να προστατευθεί ο πειραματιστής.

2. Άκρες σιφωνίων, σωλήνες φυγοκεντρωτών, σιφώνια – RNase δεν μπορεί να αδρανοποιηθεί από τη αποστείρωση μόνο, έτσι οι άκρες σιφωνίων και οι σωλήνες φυγοκεντρωτών πρέπει να αντιμετωπιστούν με DEPC, ακόμα κι αν είναι χαρακτηρισμένοι ως DEPC που αντιμετωπίζεται. Είναι καλύτερο να χρησιμοποιηθεί ένα ειδικής χρήσης σιφώνιο, να το σκουπίσει με μια σφαίρα βαμβακιού οινοπνεύματος 75% πριν τη χρήση, ειδικά η ράβδος επιπλέον, να είστε βέβαιος να μην χρησιμοποιήσει επικεφαλής remover.

3. Το νερό/ο απομονωτής πρέπει να είναι χωρίς RNase μόλυνση.

4. Τουλάχιστον ο πίνακας δοκιμής πρέπει να σκουπιστεί καθαρός με τις σφαίρες βαμβακιού οινοπνεύματος 75%.

• Ενδογενές RNase όλοι οι ιστοί περιέχει τα ενδογενή ένζυμα, τόσο το γρήγορο πάγωμα των ιστών με το υγρό άζωτο είναι ο καλύτερος τρόπος να μειωθεί η υποβάθμιση. Η μέθοδος αποθήκευσης/λείανσης υγρού αζώτου είναι πράγματι ενοχλητική, αλλά είναι ο μόνος τρόπος για τους ιστούς με τα υψηλά επίπεδα των ενδογενών ενζύμων.

6. Τα προϊόντα εξαγωγής RNA δειγμάτων RNA μπορούν να περιέχουν τα ίχνη RNase μόλυνσης.

7. Η εξαγωγή πλασμιδίων εξαγωγής πλασμιδίων χρησιμοποιεί συχνά Rnase για να υποβιβάσει το RNA, και υπόλοιπο Rnase πρέπει να αφομοιωθεί με την πρωτεϊνάση Κ και να εξαχθεί από PCI.

8. Η αποθήκευση RNA ακόμα κι αν αποθηκεύεται στη χαμηλή θερμοκρασία, ποσά ιχνών RNase θα προκαλέσει την υποβάθμιση RNA. Η καλύτερη λύση για τη μακροπρόθεσμη συντήρηση του RNA είναι μια αλατισμένη/αναστολή οινοπνεύματος, επειδή το οινόπνευμα εμποδίζει όλη την ενζυματική δραστηριότητα στις χαμηλές θερμοκρασίες.

9. Όταν τα κατιόντα (ασβέστιο, MG) περιέχουν αυτά τα ιόντα, η θέρμανση σε 80C για 5 λεπτά θα αναγκάσει το RNA για να διασπαστεί, έτσι εάν το RNA πρέπει να θερμαθεί, η λύση συντήρησης πρέπει να περιέχει έναν σχηματίζοντας χηλική ένωση πράκτορα (κιτρικό άλας νατρίου 1mM, pH 6,4).

10. Τα ένζυμα που χρησιμοποιούνται στα επόμενα πειράματα μπορούν να μολυνθούν από RNase.

10 άκρες για την εξαγωγή RNA

1: Γρήγορα αποτρέψτε RNase τη δραστηριότητα. Τα δείγματα είναι γρήγορα παγωμένα μετά από τη συλλογή, και RNase αδρανοποιείται από τη γρήγορη λειτουργία κατά τη διάρκεια της λύσης.

2: Επιλέξτε μια κατάλληλη μέθοδο εξαγωγής για τον ιστό με την υψηλή περιεκτικότητα σε ribozyme, και ο λιπαρός ιστός είναι καλύτερος να χρησιμοποιήσει τη μέθοδο που περιέχει τη φαινόλη.

3: Η ποιότητα πρόβλεψης απαιτεί βόρειο, cDNA η κατασκευή βιβλιοθηκών απαιτεί την υψηλή ακεραιότητα, και το rt-pcr και RPA (δοκιμή προστασίας ριβονουκλεάσης) δεν απαιτούν την υψηλή ακεραιότητα. Το rt-pcr απαιτεί την υψηλή αγνότητα (υπολείμματα ενζυμικών ανασταλτικών παραγόντων).

4: Η λεπτομερής ομογενοποίηση είναι το κλειδί στη βελτίωση της παραγωγής και τη μείωση της υποβάθμισης.

5: Ελέγξτε την ακεραιότητα της ανίχνευσης ηλεκτροφόρησης RNA, 28S: 18S = 2: 1 είναι ένα πλήρες σημάδι, 1: 1 είναι επίσης αποδεκτό για τα περισσότερα πειράματα.

6: Η αφαίρεση του DNA για το rt-pcr, ανάλυση σειράς αυτό είναι καλύτερη να χρησιμοποιήσει Dnase Ι για να αφαιρέσει το DNA.

7: Μειώστε τη μόλυνση των εξωγενών ενζύμων - τα ένζυμα δεν μπορούν να εισαχθούν από το εξωτερικό.

8: Κατά συγκέντρωση του νουκλεϊνικού οξέος χαμηλός-συγκέντρωσης, την αντιδραστήριο ομο-πτώσης πρέπει να προστεθεί. Αλλά για να αποτρέψει το ομο-precipitant τα ένζυμα και τη μόλυνση DNA.

9: Λεπτομερώς διαλύστε το RNA εάν είναι απαραίτητο, θερμότητα σε 65C για 5 λεπτά.

κατάλληλη μέθοδος αποθήκευσης

Μπορεί να αποθηκευτεί – 20C για μια σύντομη περίοδο, και – σε 80C για πολύ καιρό. Το πρώτο βήμα στη βελτίωση των παραγωγών RNA είναι να συνειδητοποιηθεί ότι η περιεκτικότητα σε RNA των διαφορετικών δειγμάτων ποικίλλει πολύ. Υψηλή αφθονία (2-4ug/mg) όπως το συκώτι, πάγκρεας, καρδιά, μέση αφθονία (0.05-2ug/mg) όπως ο εγκέφαλος, έμβρυο, νεφρό, πνεύμονας, θύμος αδένας, ωοθήκη, χαμηλή αφθονία (<0>

1: Lyse τα κύτταρα για να απελευθερώσετε το RN – εάν το RNA δεν απελευθερώνεται, η παραγωγή θα μειωθεί. Η ηλεκτρική ομογενοποίηση λειτουργεί καλύτερα από άλλες μεθόδους ομογενοποίησης, αλλά μπορεί επίσης να πρέπει να συνδυαστεί με άλλες μεθόδους, όπως η πολτοποίηση υγρού αζώτου, ενζυματική πέψη (Lysozyme/Lyticase)

2: Βελτιστοποίηση της μεθόδου εξαγωγής. Τα μεγαλύτερα προβλήματα με τις φαινόλη-βασισμένες μεθόδους είναι ελλιπής στρωματοποίηση και μερική απώλεια RNA (το υπερκείμενο νερό δεν μπορεί να αφαιρεθεί εντελώς). Η ελλιπής στρωματοποίηση οφείλεται στο υψηλό νουκλεϊνικό οξύ και την περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη, τα οποία μπορούν να λυθούν με την αύξηση του ποσού lysate χρησιμοποιούμενου ή τη μείωση του ποσού δείγματος. Ένα βήμα της εξαγωγής χλωροφορμίου προστέθηκε στο λιπαρό ιστό. Η απώλεια RNA μπορεί να μειωθεί με την πίσω-άντληση ή με την αφαίρεση του οργανικού στρώματος που ακολουθείται από τη φυγοκεντρικότητα. Το μεγαλύτερο πρόβλημα με φυγοκεντρικότητα-βασισμένες τις στην στήλη μεθόδους είναι υπερβολικό δείγμα.

Κλασικές άκρες εξαγωγής

1. Καθαρισμός φαινολών: Προσθέστε έναν ίσο όγκο της φαινόλης/του χλωροφορμίου και του μίγματος 1:1 σθεναρά για 1-2 λεπτά. Υποβάλτε σε φυγοκέντρωση με υψηλή ταχύτητα για 2 λεπτά. Προσεκτικά αφαιρέστε το υπερκείμενο νερό (80-90%). Μην φτάστε ποτέ στο μέσο στρώμα. Ένας ίσος όγκος της λύσης αντίδρασης μπορεί να προστεθεί στη φαινόλη/το χλωροφόρμιο και τον επιπλέοντα αφαιρούμενο. Τα δύο supernatants μπορούν να αναμιχθούν μαζί για τη νουκλεϊνική όξινη πτώση για να βελτιώσουν την παραγωγή. Να μην είστε πάρα πολύ ευγενής κατά το μίξη, και μην προσπαθήστε να αφαιρέσετε όλο το υπερκείμενο νερό.

2. Πλύσιμο με την αιθανόλη 70-80%: Κατά τη διάρκεια της πλύσης, το νουκλεϊνικό οξύ πρέπει να ανασταλεί για να εξασφαλίσει ότι το υπόλοιπο άλας πλένεται μακριά. Συγχρόνως, αμέσως μετά από να χύσει από την αιθανόλη, υποβάλτε σε φυγοκέντρωση με υψηλή ταχύτητα για λίγα δευτερόλεπτα, και έπειτα αφαιρεί την υπόλοιπη αιθανόλη με ένα σιφώνιο. Διαλύστε μετά από να αντιπροσωπεύσει στη θερμοκρασία δωματίου 5-10 λεπτά.

11. Εξαγωγή των ειδικών οργανώσεων

1. Ινώδης ιστός: Το κλειδί για την εξαγωγή RNA από τον ινώδη ιστό όπως η καρδιά/ο σκελετικός μυς είναι να αναστατωθεί εντελώς ο ιστός. Αυτοί οι ιστοί έχουν τη χαμηλή πυκνότητα κυττάρων, έτσι το ποσό RNA ανά βάρος μονάδων του ιστού είναι χαμηλό, και είναι καλύτερο να χρησιμοποιηθεί όσο το δυνατόν περισσότερο αρχικό ποσό. Να είστε βέβαιος να αλέσει τον ιστό λεπτομερώς υπό τους όρους παγώματος.

2. Ιστοί με υψηλό - περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη/λίπους: η περιεκτικότητα σε εγκέφαλο/φυτικού λίπους είναι υψηλή. Μετά από την εξαγωγή PCI, το υπερκείμενο νερό περιέχει τους άσπρους θυσάνους. Το υπερκείμενο νερό πρέπει να αποσπαστεί εκ νέου με το χλωροφόρμιο.

3. Ιστοί με την υψηλή περιεκτικότητα σε νουκλεϊνικό οξύ/ribozyme: η σπλήνα/ο θύμος αδένας έχει την υψηλή περιεκτικότητα σε νουκλεϊνικό οξύ και ribozyme. Ο αλέθοντας ιστός υπό τους όρους παγώματος που ακολουθούνται από τη γρήγορη ομογενοποίηση μπορεί αποτελεσματικά να αδρανοποιήσει ribozymes. Εντούτοις, εάν το lysate είναι πάρα πολύ ιξώδες (λόγω της υψηλής περιεκτικότητας σε νουκλεϊνικό οξύ), η εξαγωγή PCI δεν θα είναι σε θέση να στρωματοποιήσει αποτελεσματικά η προσθήκη περισσότερου lysate μπορεί να επιλύσει αυτό το ζήτημα. Οι πολλαπλάσιες εξαγωγές PCI μπορούν να αφαιρέσουν περισσότερο υπόλοιπο DNA. Εάν ένα άσπρο ίζημα διαμορφώνει αμέσως μετά από να προσθέσει το οινόπνευμα, δείχνει τη μόλυνση DNA. Re-extraction με όξινο PCI μετά από τη διάλυση μπορεί να αφαιρέσει τη μόλυνση DNA.

4. Ιστός εγκαταστάσεων: Ο ιστός εγκαταστάσεων είναι πιό σύνθετος από το ζωικό ιστό. Γενικά, οι εγκαταστάσεις αλέθονται υπό τους όρους υγρού αζώτου, έτσι η υποβάθμιση RNA από τα ενδογενή ένζυμα είναι ασυνήθιστη. Εάν το πρόβλημα υποβάθμισης δεν επιλύεται, σχεδόν βεβαίως προκαλείται από τις ακαθαρσίες που περιλαμβάνονται στο δείγμα. Οι ακαθαρσίες που περιλαμβάνονται σε πολλές εγκαταστάσεις θα οδηγήσουν στα υπολείμματα, και ο λόγος για τα υπολείμματα είναι συχνά επειδή αυτές οι ακαθαρσίες έχουν μερικές ομοιότητες με το RNA: κατακρημνίζετε και κατακρημνίζω, και προσροφάτε και προσροφώ. Αυτά τα χαρακτηριστικά καθορίζουν ότι είναι πολύ ισχυροί ενζυμικοί ανασταλτικοί παράγοντες.

Αυτή τη στιγμή, τα εμπορικά αντιδραστήρια εξαγωγής RNA μπορούν να προσαρμοστούν σχεδόν σε όλους τους ζωικούς ιστούς με τις μικρές ρυθμίσεις, αλλά υπάρχουν λίγα εμπορικά αντιδραστήρια εξαγωγής RNA που μπορούν να είναι κατάλληλα για τους περισσότερους ιστούς εγκαταστάσεων. Ευτυχώς, Foregene μπορεί να παρέχει τις ειδικές εξαρτήσεις εξαγωγής RNA εγκαταστάσεων, έχουμε τη συνολική εξάρτηση απομόνωσης RNA εγκαταστάσεων, συνολική εξάρτηση απομόνωσης RNA εγκαταστάσεων συν. Το τελευταίο σχεδιάζεται ειδικά για τις εγκαταστάσεις με την υψηλή περιεκτικότητα σε πολυσακχαρίτες και polyphenol. Για την εξαγωγή RNA, ανατροφοδοτήστε από τους χρήστες εργαστηρίων είναι ιδιαίτερα καλός.

12. Η επίδραση του δείγματος που παγώνει και που ξεπαγώνει το παγωμένο δείγμα μπορεί να είναι μεγαλύτερη, και πρέπει να κοπεί πρίν χρησιμοποιείται για την εξαγωγή RNA. Τα δείγματα τείνουν να λειώσουν (ενδεχομένως μερικώς) κατά τη διάρκεια της κοπής. Τα παγωμένα δείγματα μπορεί να πρέπει να ζυγιστούν πριν από την εξαγωγή RNA, και το ξεπαγώνω θα εμφανιστεί σίγουρα κατά τη διάρκεια αυτής της διαδικασίας. Μερικές φορές, το ξεπαγώνω του δείγματος εμφανίζεται επίσης κατά τη διάρκεια της διαδικασίας άλεσης υγρού αζώτου ή το παγωμένο δείγμα προστίθεται άμεσα στο lysate χωρίς άλεση υγρού αζώτου, και το ξεπαγώνω θα εμφανιστεί σίγουρα πριν από την πλήρη ομογενοποίηση. Τα πειράματα έχουν δείξει ότι ο παγωμένος ιστός είναι περισσότερη επιρρεπής σε υποβάθμιση RNA κατά τη διάρκεια του ξεπαγώνωτος από το φρέσκο ιστό. Ο πιθανός λόγος: Η freeze-thaw διαδικασία αναστατώνει τις δομές μέσα στο κύτταρο, που διευκολύνει τα ενδογενή ένζυμα να μπει σε η απευθείας επαφή με το RNA.

13. Η κρίση της ποιότητας RNA συνήθως, ηλεκτροφόρηση χρησιμοποιείται για να κρίνει την ακεραιότητα του RNA, και A260/A280 χρησιμοποιείται για να κρίνει την αγνότητα του RNA. Θεωρητικά, το άθικτο RNA έχει μια αναλογία 28S: 18S = το 2.7:1, και τα περισσότερα στοιχεία υπογραμμίζουν την αναλογία 28S: 18S = 2:1. Το γεγονός είναι ότι σχεδόν κανένα από το RNA που εξάγεται από τα δείγματα εκτός από τα κύτταρα δεν είναι σε αναλογία 2:1 (αυτό λήφθηκε χρησιμοποιώντας το Agilent Bioanalyzer).

Τα αποτελέσματα ηλεκτροφόρησης του RNA επηρεάζονται από πολλούς παράγοντες, συμπεριλαμβανομένης της δευτεροβάθμιας δομής, των όρων ηλεκτροφόρησης, του φορτίου δειγμάτων, του βαθμού κορεσμού από EB, κ.λπ. Χρησιμοποιήστε την εγγενή ηλεκτροφόρηση για να ανιχνεύσετε το RNA και το δείκτη DNA χρήσης ως έλεγχο. Εάν τα 28S σε 2kb και το 18S σε 0.9kb είναι σαφή, και 28S: 18S > 1, η ακεραιότητα μπορεί να καλύψει τις απαιτήσεις των περισσότερων επόμενων πειραμάτων.

A260/A280 είναι ένας δείκτης που έχει προκαλέσει πολλή σύγχυση. Καταρχάς, είναι απαραίτητο να διευκρινιστεί η αρχική έννοια αυτού του δείκτη για τα νουκλεϊνικά οξέα: καθαρό RNA, του A260/280 = περίπου 2,0. Το καθαρό RNA είναι επειδή και A260/A280 = 2 είναι η “επίδραση”. Τώρα ο καθένας χρησιμοποιεί A260/A280 ως because, σκεπτόμενος ότι «εάν A260/A280 = 2, κατόπιν RNA είναι καθαρά», το οποίο οδηγεί φυσικά στη σύγχυση.

Εάν ενδιαφέρεστε, μπορείτε να προσθέσετε ένα μικρό αντιδραστήριο που χρησιμοποιείται συχνά στην εξαγωγή, όπως η φαινόλη, guanidine isothiocyanate, ο ΓΟΜΦΟΣ, κ.λπ., στο δείγμα RNA σας, και μετρά έπειτα την αναλογία A260/A280. Η πραγματικότητα είναι ότι πολλές από τα αντιδραστήρια που χρησιμοποιούνται για την εξαγωγή RNA, καθώς επίσης και πολλές ακαθαρσίες στο δείγμα, απορροφούν γύρω από A260 και A280, έχοντας επιπτώσεις σε A260/A280.

Η πιό διδακτική προσέγγιση είναι αυτή τη στιγμή να ανιχνευθούν τα δείγματα RNA στο ποσοστό 200-300 NM. Η καμπύλη του καθαρού RNA έχει τα ακόλουθα χαρακτηριστικά: η καμπύλη είναι ομαλή, A230 και A260 είναι δύο σημεία κάμψης, A300 είναι στενό σε 0, A260/A280 = περίπου 2,0, και A260/A230 = περίπου 2,0. Εάν τα στοιχεία ανίχνευσης δεν είναι διαθέσιμα, η αναλογία A260/A230 πρέπει επίσης να καθοριστεί, δεδομένου ότι αυτή η αναλογία είναι πιό ευαίσθητη στη μεταφορά όλων των ακαθαρσιών που έχουν επιπτώσεις στην ενζυματική αντίδραση. Λάβετε υπόψη τη γραμμική σειρά της συσκευής (0.1-0.5 για A260).

Υπάρχουν δύο άλλα χρήσιμα φαινόμενα: η αναλογία θα είναι περίπου 0,3 χαμηλότερα πότε A260/A280 μετριέται στο νερό ενώ η αναλογία μέτρησε EDTA 10 χιλ. είναι περίπου 0,2 υψηλότερο από αυτό που μετρήθηκε EDTA 1 χιλ.