Συχνές ερωτήσεις για κιτ απομόνωσης ολικού RNA ζώων/κυττάρων

Η ακόλουθη ανάλυση των προβλημάτων που μπορεί να αντιμετωπίσετε στην εξαγωγή RNA ζωικού ιστού/κυττάρου θα σας βοηθήσει με τα πειράματά σας.Επιπλέον, για άλλα πειραματικά ή τεχνικά προβλήματα εκτός από τις οδηγίες λειτουργίας και την ανάλυση προβλημάτων, έχουμε ειδική τεχνική υποστήριξη για να σας βοηθήσουμε.Εάν έχετε οποιεσδήποτε ανάγκες, επικοινωνήστε μαζί μας στο: 028-83360257 ή E-mali: Tech@foregene.com.

Το RNA δεν εκχυλίζεται ή οι αποδόσεις RNA είναι χαμηλές

Υπάρχει συχνά μια ποικιλία παραγόντων που επηρεάζουν την αποτελεσματικότητα ανάκτησης, όπως: η περιεκτικότητα RNA δείγματος ιστού, η μέθοδος λειτουργίας, ο όγκος έκλουσης κ.λπ.

1. Πραγματοποιήθηκε φυγοκέντρηση με παγόλουτρο ή κρυογονική (4 °C) κατά τη λειτουργία.

Σύσταση: Λειτουργήστε σε θερμοκρασία δωματίου (15-25°C) καθ' όλη τη διάρκεια της διαδικασίας, μην κάνετε παγόλουτρο και φυγοκεντρήστε σε χαμηλές θερμοκρασίες.

2. Ακατάλληλη διατήρηση του δείγματος ή υπερβολικός χρόνος αποθήκευσης του δείγματος.

Σύσταση: Αποθηκεύστε τα δείγματα στους -80 °C ή καταψύξτε σε υγρό άζωτο και αποφύγετε την επαναλαμβανόμενη χρήση κατάψυξης-απόψυξης.προσπαθήστε να χρησιμοποιήσετε φρέσκο ​​ιστό ή καλλιεργημένα κύτταρα για εξαγωγή RNA.

3. Ανεπαρκής λύση δείγματος.

Σύσταση: Κατά την ομογενοποίηση ιστού, βεβαιωθείτε ότι ο ιστός είναι επαρκώς ομογενοποιημένος και ότι τα κύτταρα του ιστού είναι επαρκώς διαιρεμένα ώστε να εξηγείται η απελευθέρωση RNA.

4. Το εκλουστικό δεν προστίθεται σωστά.

Σύσταση: Επιβεβαιώστε ότι το ddH2O Χωρίς RNase προστίθεται στάγδην στο μέσο της μεμβράνης της στήλης καθαρισμού.

5. Ο σωστός όγκος απόλυτης αιθανόλης δεν προστέθηκε στο ρυθμιστικό διάλυμα RL2 ή στο ρυθμιστικό διάλυμα RW2.

Σύσταση: Ακολουθήστε τις οδηγίες, προσθέστε τον σωστό όγκο απόλυτης αιθανόλης στο Buffer RL2 και στο Buffer RW2 και ανακατέψτε καλά πριν χρησιμοποιήσετε το κιτ.

6. Η δόση του δείγματος ιστού δεν είναι κατάλληλη.

Σύσταση: Χρησιμοποιήστε 10-20 mg ιστού ή (1-5) × 106 κύτταρα ανά 500 μl ρυθμιστικού διαλύματος RL1, καθώς η υπερβολική χρήση ιστού μπορεί να οδηγήσει σε μειωμένη εξαγωγή RNA.

7. Ακατάλληλος όγκος έκλουσης ή ατελής έκλουση.

Σύσταση: Ο όγκος έκλουσης της στήλης καθαρισμού είναι 50-200 μl.εάν το αποτέλεσμα έκλουσης δεν είναι ικανοποιητικό, συνιστάται η παράταση του χρόνου τοποθέτησης σε θερμοκρασία δωματίου μετά την προσθήκη προθερμασμένου ddH2O Χωρίς RNase, π.χ. για 5-10 λεπτά.

8. Η στήλη καθαρισμού έχει υπόλειμμα αιθανόλης μετά από πλύση με ρυθμιστικό διάλυμα RW2.

Σύσταση: Εάν υπάρχει υπόλειμμα αιθανόλης μετά από πλύση με ρυθμιστικό διάλυμα RW2, φυγοκέντρηση με άδειο σωλήνα για 1 λεπτό, ο χρόνος για τη λειτουργία φυγοκέντρησης με άδειο σωλήνα μπορεί να αυξηθεί στα 2 λεπτά ή η στήλη καθαρισμού μπορεί να τοποθετηθεί σε θερμοκρασία δωματίου για 5 λεπτά για να αφαιρεθεί επαρκώς το υπόλοιπο αιθανόλη.

Το καθαρισμένο RNA αποικοδομείται

Η ποιότητα του καθαρισμένου RNA σχετίζεται με παράγοντες όπως η διατήρηση του δείγματος, η μόλυνση με RNase και ο χειρισμός κ.λπ.

1. Τα δείγματα ιστών δεν διατηρούνται έγκαιρα.

Σύσταση: Εάν δείγματα ιστού ή κύτταρα δεν χρησιμοποιηθούν έγκαιρα μετά τη συλλογή, κρυοσυντηρήστε αμέσως στους -80 °C ή σε υγρό άζωτο.Για να εξαγάγετε RNA, χρησιμοποιήστε ένα δείγμα ιστού ή κυττάρου που μόλις λάβατε όποτε είναι δυνατόν.

2. Επαναλαμβανόμενη κατάψυξη-απόψυξη δειγμάτων ιστού.

Σύσταση: Όταν αποθηκεύετε δείγματα ιστού, είναι καλύτερο να τα κόβετε σε μικρά κομμάτια για συντήρηση και να αφαιρείτε ένα από τα κομμάτια όταν τα χρησιμοποιείτε για να αποφύγετε την επαναλαμβανόμενη κατάψυξη-απόψυξη του δείγματος και την αποικοδόμηση του RNA.

3. Η RNase εισάγεται ή δεν φοράτε γάντια μιας χρήσης, μάσκες κ.λπ. κατά τη διάρκεια της επέμβασης.

Σύσταση: Τα πειράματα εκχύλισης RNA γίνονται καλύτερα σε ξεχωριστούς χώρους χειρισμού RNA και ο πίνακας καθαρίζεται πριν από το πείραμα.

Φοράτε γάντια και μάσκες μιας χρήσης κατά τη διάρκεια του πειράματος για να ελαχιστοποιήσετε την αποικοδόμηση του RNA που προκαλείται από την εισαγωγή της RNase.

4. Τα αντιδραστήρια μολύνονται με RNase κατά τη χρήση.

Σύσταση: Αντικαταστήστε με ένα νέο κιτ απομόνωσης ολικού RNA ζώων για σχετικά πειράματα.

5. Οι σωλήνες φυγοκέντρησης, τα άκρα κ.λπ. που χρησιμοποιούνται στον χειρισμό του RNA είναι μολυσμένα με RNase.

Σύσταση: Επιβεβαιώστε ότι οι σωλήνες φυγοκέντρησης, τα άκρα, οι πιπέτες κ.λπ. που χρησιμοποιούνται στην εξαγωγή RNA είναι όλα Χωρίς RNase.

Το καθαρισμένο ληφθέν RNA επηρεάζει τα κατάντη πειράματα

Το RNA που καθαρίζεται από τη στήλη καθαρισμού, εάν τα ιόντα άλατος, η περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη είναι πολύ μεγάλη θα επηρεάσει το κατάντη πείραμα, όπως: αντίστροφη μεταγραφή, Northern Blot et al.

1. Το εκλουόμενο RNA έχει υπολείμματα ιόντων άλατος.

Σύσταση: Επιβεβαιώστε ότι ο σωστός όγκος αιθανόλης έχει προστεθεί στο Buffer RW2 και εκτελέστε 2 πλύσεις στη στήλη καθαρισμού στην φυγοκεντρική ταχύτητα που υποδεικνύεται για λειτουργία.Εάν υπάρχει υπόλειμμα ιόντων άλατος, αφήστε τη στήλη καθαρισμού στο ρυθμιστικό διάλυμα RW2 για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και πραγματοποιήστε φυγοκέντρηση για να μεγιστοποιήσετε την απομάκρυνση της μόλυνσης από αλάτι.

2. Κατάλοιπο αιθανόλης σε εκλουόμενο RNA.

Σύσταση: Επιβεβαιώστε ότι μετά την πλύση με ρυθμιστικό διάλυμα RW2, εκτελέστε τη λειτουργία φυγοκέντρησης με άδειο σωλήνα με την ταχύτητα φυγοκέντρησης που υποδεικνύεται για λειτουργία, αυξήστε το χρόνο της λειτουργίας φυγοκέντρησης με άδειο σωλήνα στα 2 λεπτά εάν υπάρχουν ακόμη υπολείμματα αιθανόλης ή αφήστε το σε θερμοκρασία δωματίου για 5 λεπτά μετά τη φυγοκέντρηση με άδειο σωλήνα για να μεγιστοποιηθεί η απομάκρυνση των υπολειμμάτων αιθανόλης.